单克隆抗体制备中，成功获得杂交细胞后，除对阳性孔进行克隆化、扩大培养外，也要及时冻存阳性孔的杂交瘤细胞，以免细胞传代培养过程中发生突变、污染或出现细胞分泌抗体能力丧失等不良后果。
杂交瘤细胞的冻存实验步骤
- 将冻存液保存于4℃冰箱备用，冻存管高压灭菌备用。
- 选择生长旺盛、饱满透明的杂交瘤细胞，用无菌滴管吹下，2000r/min离心5min，弃去上清液。
- 将细胞沉淀物悬于预冷的细胞冻存液中，制成2～6×106个/mL细胞悬液。并分装于细胞冻存管，每只1mL。
- 冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时，一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中；或细胞管降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中；也可以用细胞冻存装置进行冻存。
杂交瘤细胞的复苏实验步骤
- 将水浴锅预热37℃，细胞培养液提前预热，取5～10mL于15mL离心管中。
- 从液态氮中取出冷冻管，立即投入37℃水浴锅中，轻轻摇动，在1～1.5min内使冻存的细胞解冻。
- 取出后，用75%乙醇消毒管外壁，放入超净台，将细胞转移到含5～10ml不完全培养液的15ml离心管中， 800～1000r/min离心5min。
- 弃上清，加入细胞培养液，移入事先准备好的含有饲养层细胞的培养瓶中。轻轻摇动培养瓶，使细胞分散均匀，然后将培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。
- 根据细胞生长速度，2～3天更换一次培养液，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
实验材料及仪器
实验材料及仪器
实验材料：稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实验仪器：无菌滴管，培养瓶等器材，冰箱、培养箱、离心机，超净工作台等设备。
培养液配方：
细胞冻存液：50%胎牛血清,10%二甲基亚砜,40%RPMI-1640培养基
细胞冻存液：50%胎牛血清,10%二甲基亚砜,40%RPMI-1640培养基,细胞培养液：20%胎牛血清,75%RPMI-1640培养基,1%谷氨酰胺,1%双抗,最后用8.8%NaHCO3调培养液pH至7.2～7.4。
注意事项
- 冻存液最好预冷，操作时动作要轻且迅速。
- 冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性。
- 保证细胞培养液新鲜，采用少量多次配制，或培养基保存于-20℃冰箱。
- 细胞冻存与复苏的原则是慢冻快复，最大程度的保证细胞复苏的成功率。