辣根过氧化物酶（HRP）是一种含亚铁血红素的蛋白质，广泛分布于植物界，以在辣根中含量高而得名，分子质量约为40KDa。HRP作为酶标记抗体是通过共价键经适当的方法将酶联接在抗体上，形成酶标抗体后再通过酶对底物的特异性催化作用，生成有色不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，利用肉眼、光学显微镜或电子显微镜可对结果进行观察。
HRP由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成，该酶的活性中心含铁卟啉即辅基，在403nm波长处呈现最高吸收峰，酶蛋白部分吸收波长为275nm，HRP的纯度为二者的吸光度比值RZ[1] ，该酶与抗体标记的方法有多种，根据酶的结构可分为戊二醛两步法和过碘酸钠法两种方式标记抗体。
HRP抗体标记的方法
戊二醛两步标记法
戊二醛（GA）是常用的双功能基团交联剂，它的两个功能基可以与HRP和抗体上的氨基结合，形成HRP-GA-IgG结合物。在两步法中先将酶与过量的GA反应，形成二者的结合物，然后再将该结合物进一步与抗体蛋白质分子的氨基交联，形成酶标记抗体。
标记步骤
- 称取HRP 25mg（RZ=3）溶于0.2ml 12.5%GA溶液中，于室温下静置过夜；
- 反应后的酶溶液过SepHadex G-25柱层析，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/min，收集棕色流出液；
- 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中；
- 加入1mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液0.25ml，调pH至9.0~9.5后，继续搅拌3~4h；
- 加入0.2mol/L赖氨酸0.25ml，混匀后放置室温2h；
- 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1h；
- 3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/L pH7.4 的PBS 中；
- 上述溶液装入透析袋中，对0.15mol/L pH7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后（用纳氏试剂检测），10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等量60%的甘油分装，于4℃或-20℃冰冻保存。
标记物质量鉴定
用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向免疫琼脂糖或免疫电泳测定，然后用酶的底物使沉淀物显色，可初步鉴定其活性，最后以直接ELISA对酶结合物进行滴定。
简易过碘酸钠标记法
利用过碘酸钠将HRP的糖基氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合形成Schiff碱 [2]。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。 此方法只适用于含糖量较高的酶。
标记步骤
- 称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；
- 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟；
- 将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
- 加20μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG（抗体，或SPA5mg）在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；
- 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时；
- 将上述液装入透析袋中，对0.15M pH7.4 PBS透析，去除铵离子后（用纳氏试剂检测），10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等量60%的甘油分装，于4℃或-20℃冰冻保存。分装前按照10mg/ml的比例加入BSA作为其稳定保护剂。
注意事项
- 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高，效价高（最低1∶16），纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件；
- 所使用试剂的pH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好（或必需）新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质），否则影响标记效果；
- 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，需认真检查防止漏液；
- 浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。
[1] RZ（Reinheit Zethl）值：即纯度值，以酶活性中心的最大吸光度（A）与其余非活性酶蛋白部分的A值比较。一般认为标记酶的RZ值为3.0左右，RZ值越小，酶的纯度越差。
[2] Schiff碱：也称希夫式碱，主要指含有亚胺或亚甲胺特性基团（-RC=N-）的一类有机化合物，通常由胺和活性羧基缩合而成。具有优良液晶特性，一般用作有机合成试剂盒液晶材料。