某些物质在光的照射下，吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，可以电磁辐射形式放出所吸收的光能，此现象称为光致发光。在此现象中，如用一短波长的光照射该物质，它在极短的时间内能发射出波长比照射光长的光，即为荧光。荧光素是一些具有这种特性的染料。20世纪40年代，FITC异硫氰酸荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原，并获得成功。从此创建了免疫荧光抗体标记技术。该技术将抗原抗体反应的高特异性与荧光的敏感可测性有机结合起来，可以准确、特异、灵敏、快速地检测和定位未知且微量的抗原，目前已广泛地应用于生命科学研究的多种领域及学科。

FITC标记抗体的原理

FITC异硫氰酸荧光素是目前较为常用的标记抗体的方法，FITC一般呈黄色、褐色或褐黄色粉末或结晶，性质稳定在低温中能保存数年。在碱性条件下，FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基共价结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个抗体分子上最多能标记15~20个FITC分子，被标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，通过荧光显微镜进行观察或利用流式细胞仪分析，从而对抗原进行定性、定位或定量。

FITC标记抗体方法

FITC抗体标记主要有Marshall直接标记法、Chadwick间接标记法、改良标记法和透析法四种。

Marshall直接标记法

  • 抗体的准备：取提纯的Ig溶液测定蛋白质含量，置于三角烧瓶中加入生理盐水和0.5mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，冰槽中搅拌5~10min；
  • 荧光素的准备：按每毫克蛋白质加0.01~0.02mg的FITC计算，准确称取后加入抗体溶液中；
  • 标记：边搅拌边加入荧光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰库继续搅拌12~18h；
  • 透析：结合完毕后，先将结合物以3000r/min离心20min，除去少量沉淀物后装入透析袋中再置于pH8.0缓冲盐的烧杯中透析过夜；
  • 过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离的FITC，收集标记的荧光抗体进行鉴定。

Chadwick间接标记法

  • 抗体的准备：0~4℃下，用0.01mol/L pH8.0 PBS将待标记的抗体蛋白溶液稀释到浓度为30~40mg/ml，置于三角烧瓶内放入冰槽中；
  • 荧光素的准备：按每毫克蛋白质加入0.01mg的荧光素称取，溶解于等量的3%重碳酸钠水溶液中；将抗体蛋白溶液与FITC溶液等量混合，在0~4℃中搅拌18~24h，充分搅匀；
  • 透析或过柱层析。

改良法

  • 抗体的准备：取提纯的Ig溶液测定蛋白质含量，置于三角烧瓶中加入生理盐水和0.5mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液，冰槽中搅拌5~10min；
  • 荧光素的准备：按每毫克蛋白质加0.01~0.02mg的FITC计算，准确称取后加入抗体溶液中；
  • 标记：边搅拌边加入荧光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰库继续搅拌12~18h；
  • 用半饱和硫酸铵将标记的抗体蛋白沉淀分离，3000r/min离心30min，倾去上清液中的游离荧光素，再用缓冲盐水透析除去硫酸铵。将制备好的荧光抗体加0.01%NaN3,分装保存。

透析法

  • 用0.025mol/L PH9.2碳酸盐缓冲液，将待标记的抗体蛋白稀释成1%浓度，装入透析袋中；
  • 用同一缓冲液将FITC制成0.1mg/ml的溶液，置于圆形容器内，并将透析袋浸没其中，4℃搅拌24h；
  • 取出透析袋中标记液。立即过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，除去游离荧光素，收集荧光抗体进行鉴定。

荧光抗体质量控制

FITC荧光标记抗体的质量鉴定，包括特异性和敏感性的鉴定。

染色特异性和敏感性的鉴定

  • 特异性染色效价的测定：直接染色时以1:2、1:4、1:8等倍比稀释荧光抗体溶液，与相应的抗原标本做一系列染色，荧光强度在“+++”的最大稀释度，即为该荧光抗体的染色效价。若染色效价为1:64，在实际染色时可采用1:32或1:16。若为间接染色效价测定则可先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，实际染色用效价与直接法相同；
  • 非特异性染色：根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按照常规染色步骤，结果在标本上出现的非特异性染色应显著低于特异性染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体；
  • 吸收试验：在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃中过夜 ，3000r/min，离心30min，收集上清液，再用其染相应抗原阳性标本，结果应不出现明显阳性荧光。

F/P值测定

荧光抗体的鉴定一般是利用荧光素（F）与抗体蛋白（P）的克分子比值即F/R值，反应荧光抗体的特异性染色质量。实验要求F/R比值为1~2，过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱降低敏感性。具体方法如下：

  • 蛋白质定量：测定荧光抗体的蛋白质mg/ml；
  • 制作荧光素定量标准曲线： 称取FITC1mg溶于10ml 0.5mol/l pH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/L pH7.2 PBS稀释到100ml，得到的荧光素含量为10ug/ml并作为原液，以倍比稀释9个不同浓度的溶液。用分光光度计在490nm波长测定OD值，以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标作标准函数图；
  • 结合荧光素定量：在荧光素和蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm，读取数值后可根据公式进行计算。

FITC抗体标记注意事项

  • 影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光素和蛋白的量等，需注意控制；
  • 荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适当避免气泡的产生；
  • 层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气泡、裂隙；
  • 上样和洗脱应做到“前切”和“后切”。前切指柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品，后切指样品走至与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。