免疫沉淀技术（IP）

免疫沉淀是利用固定在磁珠等固相支持物上的特异性抗体对抗原的小型亲和纯化的方法。在对细胞裂解液分离蛋白的检测方法中，免疫沉淀技术的应用最为广泛。

什么是免疫沉淀技术（IP）？

免疫沉淀是基于传统亲和纯化方法开发的，在含有目的抗原的细胞裂解液中加入特定的抗体以及Protein A-Beads （预先将Protein A固定结合在磁珠上），根据抗原与抗体、Protein A与抗体的FC的特异性，形成“抗原-抗体-Protein A-Beads”复合物，清洗离心后去除溶液中未结合的杂蛋白，最终检测是否存在目的蛋白。与传统的柱式亲和纯化相比，免疫沉淀的目标是仅分离足够用于Western Blot或其他检测方法检测的蛋白质。通常可以将已处理和未处理的样品进行比较，从而评估目标蛋白的相对量。
在免疫沉淀实验中，用于检测的抗体可以是预固定的，或者是游离的。通常，预固定抗体法更适用于IP，但是，当目标蛋白浓度较低、抗体与抗原的结合亲和力较弱的情况下，可以使用游离的抗体形成免疫复合物，效果会比较好。

免疫沉淀固相物质的选择

对于小型特定蛋白和蛋白复合物的分离，磁珠可实现结合能力、得率、可重复性、纯度和成本节约之间的平衡。当进行手动和自动化标准IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反应并立即用于后续检测分析时，磁珠是最佳选择。利用强力磁力架可将磁珠定位到孵育管的侧壁，使其不阻碍细胞裂解物抽吸。磁性分离不需要离心，所以不会导致抗体-抗原结合破坏和目标蛋白损失现象。当需要纯化大量目标蛋白用于下游分析，且特异性抗体较易获得，琼脂糖树脂纯化较为适用。
表1:琼脂糖树脂和磁珠的比较

免疫沉淀的类型

最简单的免疫沉淀可用于分离单个蛋白（抗体的靶抗原）以研究其特性、结果、表达、活化或修饰状态。IP也用于研究初级抗体/蛋白与其他蛋白或核酸的相互作用。

• 免疫共沉淀（Co-IP）

免疫共沉淀是研究蛋白质相互作用的常见技术，基本原理与IP相同。利用抗体共沉淀裂解物中与抗原结合的抗体或相关蛋白复合物。

• 染色质免疫沉淀（ChIP）

染色质免疫沉淀分析可用于鉴定基因组中与DNA结合蛋白（如转录因子和组蛋白）结合的区域。将蛋白质与DNA暂时交联固定并剪切DNA，目标蛋白与核酸序列一起被沉淀后进行DNA鉴定。

• RNA免疫沉淀（RIP）

原理与ChIP相似，利用RNA结合蛋白被沉淀后，用RT-PCR或cDNA测序对沉淀进行RNA鉴定。

• 标签免疫沉淀

上述免疫沉淀方法中均依赖特异性识别靶蛋白的抗体，需要抗体很少或不能与胞内其他靶标发生交叉反应，存在局限性。但利用表位标记蛋白，就可以使目的蛋白更易识别特定抗体并与之结合产生沉淀。

免疫沉淀实验中抗体的固定

Protein A/G结合抗体

Protein A/G是抗体的结合蛋白，对多种不同亚类和种属的抗体具有较高的亲和力。如图所示，Protein A/G与抗体的Fc结合，将其正确固定，以便沉淀目标抗原。
Protein A/G支持物不适合某些特定的免疫沉淀实验系统，例如当免疫沉淀抗体的种属或亚类不与这些蛋白结合，或者当含有抗原的样本是血清时（血清中包含的抗体会与免疫沉淀抗体竞争结合）。

使用交联剂固定抗体

除了用Protein A/G直接捕获抗体外，还可以使用交联剂将抗体共价连接到Protein A/G上。常用的交联剂包括DSS和BS3，它们是具有胺基反应性的NHS基团的短碳链。NHS可与伯胺（赖氨酸残基的侧链）反应，生成共价酰胺键。如果抗体先与Protein A/G支持物结合，然后再与交联剂溶液混合，则交联剂分子可与抗体和Protein A/G相邻的胺基共价连接。

交联方法可以避免抗体片段共洗脱，并可重复多次使用。该方法只适用于可与Protein A/G结合的抗体。由于抗体包含多个胺基基团，且不仅只分布于Fc区段，因此必须优化交联剂的用量。如果交联剂用量过少或过多，则抗体可能无法连接至Protein A/G上，或者引起抗体结合位点上的胺基基团被过度修饰，进而导致抗体无法与抗原结合。

链霉亲和素微珠结合抗体

除了Protein A/G结合抗体外，也可以用链霉亲和素微珠去捕获抗体，这要求抗体是被生物素化的。