GFP（绿色荧光蛋白）是从水母体内发现的发光蛋白，分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成。实验室中常用的重组GFP标签更接近水母的GFP，其分子量为27kD左右。

GFP本身是一种酸性、球状、可溶性天然荧光蛋白。按一定规则，11条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏；α-螺旋把发色团固定在几乎正中心处。

图1：GFP的结构图示

GFP的发光机理

物质基础：GFP的生色团

  • 由65~67位的丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸（Ser-Tyr–Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮，形成生色团。
  • GFP发出荧光稳定，无需再添加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光。在450~490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上。适合于活体检测，在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强。
  • GFP生色团的形成没有物种特异性，可以在翻译后2~4h通过自动催化作用来合成。
  • 发色团上的共轭 π键能吸收激发光能量，在很短的时间后，以波长更长的发射光释放能量，形成荧光。

例：GFP在水母中能发光，是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移（FRET）在生物中的发现。

GFP的荧光特性

  • GFP的最大吸收峰为395nm（紫外），并有一个峰值为470nm的副峰（蓝光）；发射光谱最大峰值为509nm（绿光），并带有峰值为540nm的侧峰。
  • GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐（FITC）相似，所以GFP观察可用荧光显微镜滤光片组合。
  • GFP需在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式。

GFP的优缺点及改进方法

GFP的优点

  • 易于检测，灵敏度高；
  • 荧光稳定；
  • 对细胞无毒害作用；
  • 广谱通用性；
  • 易于构建载体；
  • 可进行活细胞实时定位观察；
  • 易于得到突变体；
  • 不受假阳性干扰。

GFP的缺点

尽管GFP作为分子探针具有多种优点，但野生型GFP仍具有一定缺点：

  • GFP有两个激发峰影响特异性，且长波激发峰强度较小，不易观察；
  • GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低；
  • GFP在某些植物细胞中不表达。

改进方法

①除去GFP基因中隐蔽型内含子；

②消除编码蛋白的积累；

③将GFP定位到特定细胞器中；

④改变碱基组分；

⑤更换GFP生色团氨基酸；

⑥插入植物内含子；

⑦增加增强子和更换强启动子。

GFP融合蛋白的构建

应用亚克隆技术将目的基因与GFP基因构建成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞，利用目的基因的表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达，最终得到融合蛋白（尽可能不影响目的蛋白的定位和功能）。

目的蛋白与GFP基因融合方式：

  • 目的基因-GFP（将GFP置于目的基因之后）
  • GFP-目的基因（将GFP置于目的基因之前）

注意事项：

  • 两个基因之间用Linker连接；
  • 在两个基因交接处增加一段核苷酸（3的倍数）使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较小，有利于GFP发光；
  • 基因在GFP之前时必须要有起始密码，不能有终止密码；基因在GFP之后必须有终止密码；
  • 构建融合基因后，必须测序进行验证，确保融合基因读框正确之后才能进行后续研究。

GFP融合蛋白的检测

  • 定性检测：可以用常规的落射荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察；
  • 定量检测：免疫印迹法，酶联免疫吸附法；
  • 可以在活细胞中进行图像分析，也可以检测固定细胞中的GFP。

注意事项：

  • 以GFP作为报告基因研究蛋白亚细胞定位，必须作对照。必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光，以免假象干扰；
  • 构建正确的融合基因不一定都能正常表达，要尽可能多的获得转基因细胞。