流式细胞仪(flow cytometer)是以流式细胞术为核心技术,集光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术于一体的先进科学技术设备。是现代科学研究中的先进仪器之一。流式细胞仪主要由液流系统、光路系统、检测分析系统三部分组成。具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。

流式细胞仪的检测原理

流式细胞术作为一种自动分析细胞的高技术,其原理是悬浮在液体中的分散细胞一个一个地依次通过测量区,当每个细胞通过测量区时产生电信号,这些信号可以代表荧光、散射光、光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存储及显示,于是细胞的一系列重要的物理性质和生化性质就被快速地、大量地测定。这些特性可以是细胞的大小、活性、核酸的数量、酶、抗原等等。流式细胞仪也可以根据规定的参数把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来。
流式细胞仪的原理
如上图,待测细胞被制备成单个细胞悬液,经特异性荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液,在鞘液的约束下,细胞排列成单列并由流动室喷嘴喷出,成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交,相交点称为测量区。通过测量区的细胞被激发产生荧光。在与入射光和液柱垂直的方向放置光学系统来收集荧光信号。

液流系统

负责将样品转移至流动室。流动室是流式细胞仪的核心部件。在流动室,被测细胞逐个通过,并在此与激光正交。在实验时进入和通过仪器的细胞流必须保持稳定,才能实现准确的计数和检测。基于压力和体积的液流系统是两种常见的机械动力学装置。
基于压力的液流系统通过产生压力使含有大量细胞的样本快速进入仪器,在封闭的样本管中利用样本和鞘液之间的压力差,将样本聚焦至光学系统。压力系统可保持平稳持续进样,进样体积更大且样本耗尽的风险较小。
流式细胞仪的结构
基于体积的液流系统能实现更灵活的细胞进样方式,并准确测量进入流式细胞仪的样本体积。体积系统可以进行细胞绝对计数,处理复杂样品且装置抗堵性能好。
流式细胞仪的结构

光路系统

不同的激光器发射出的激光照射到细胞表面产生光信号,而后经过不同的光路系统被接收。流式细胞仪采集的光信号有两种:散射光信号和激发荧光信号。散射光信号与标记荧光素无关,是细胞本身的固有参数,又分为前向散射光(forward scatter,FSC)和侧向向散射光(side scatter,SSC),FSC反映了细胞体积的大小;SSC反映了细胞内颗粒的复杂情况。荧光信号是自发荧光或被标记的荧光素分子发出的荧光,激发荧光信号代表了所标记的被测细胞内部颗粒的信息。这些光信号会转化成电信号,被传送到计算机。常用的荧光素有FITC,PE,APC,PerCP等,具有不同的激发光波长和发射光波长。
流式细胞仪的结构

检测分析系统

以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析,最后得出样品群体中细胞的物理化学特征。通道可以理解成光电倍增管,它的作用是将光信号转变为电信号,并且放大电信号。

细胞分选

细胞分选器可使被指定的细胞从细胞群体中分离出来。流式细胞术所测定的任何参数都可做为流式细胞分选器选定细胞的依据,而且被选出来的细胞的均一性与所测参数有关。关于详细的细胞分选技术,可查看文章细胞分选。

流式细胞仪的应用

在细胞生物学中的应用

  • 细胞周期分析:在细胞的不同周期,细胞内DNA含量不同,使用特定的荧光染料对细胞的DNA染色,用流式细胞仪可分析DNA的含量,从而判断细胞周期;
  • 细胞内钙离子的测定:钙离子作为细胞内许多功能蛋白的辅基及重要细胞内信使。测定细胞内钙离子变化,对于了解细胞内信息传递,细胞凋亡等都具有一定意义。通过钙离子特异的染料标记细胞,可用流式细胞仪测定钙离子变化;
  • 细胞内pH测定:利用流式细胞仪可测定细胞内pH,例如癌细胞在受到加热或化疗时,细胞内的pH下降;
  • 细胞凋亡研究:细胞凋亡不仅与个体形成等基本生命现象有关,而且与癌症等多种疾病的发生密切相关。使用流式细胞仪能精确定量凋亡细胞,并进行多参数分析。

在免疫学的应用

  • 淋巴细胞表面标志的检测;
  • 在血栓与出血性疾病中的应用:①血小板功能的测定;②血小板相关抗体的测定;
  • 通过流式细胞仪检测移植后CD34+/CD33+造血干细胞。