抗体是在病原物刺激下由B细胞增殖分化为浆细胞后所产生的一种免疫球蛋白，具有高特异性结合抗原的能力。在实验应用中，可根据其绑定能力和用途分为初级抗体（一抗）和次级抗体（二抗），但在选择最合适的抗体时应该考虑哪些影响因素呢？

一抗的选择

一抗（primary antibody）是一种免疫球蛋白，能特异性结合特定蛋白或重点研究的其他生物分子，目的是对其进行纯化、检测和测量。使用小鼠、大鼠、兔子、山羊和其他动物作为寄主，可将一抗培育成多克隆（pAb）或单克隆抗体（mAb）。在实验时选择一抗可根据以下几个方面进行考虑：

确定实验种属和类型

  • 明确实验所需的样本种属，如人、鼠、猪等，应选择物种相同或有交叉反应的抗体。
  • 确定实验类型，如WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等，一般抗体说明书会列出该抗体经试验验证过，适用于何种分析类型，如未提及并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而是说明尚未经过此种分析试验验证。如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。

抗体类型

  • 单克隆抗体：由单一B淋巴细胞产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体。单抗实验时可产生极少或无背景染色，同时可减少与非目的蛋白的交叉反应。
  • 多克隆抗体：由动物的多个B细胞克隆产生，是具有针对抗原几个表位的多种抗体混合物。多抗可识别抗原的微小变异，能够产生更强的抗原检测信号，是涉及变性蛋白质实验首选抗体。（单抗与多抗区别及选择）

分析样本蛋白的结构性质

分析了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，抗体说明书一般有相关免疫原的描述。若打算检测的是蛋白片段或是一种特殊的同型物又或是蛋白全长的某一区域，则必须选择用含有此片段域的免疫原制备的抗体。

抗体宿主物种的选择

一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要。对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应。例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。

如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大。

二抗的选择

二抗（secondary antibody）能直接与靶抗原连接的一抗结合。在一抗与抗原结合后，标记的二抗将其V区附着到一抗的茎或C区。利用这种相互作用使二抗间接地进行检测和纯化靶蛋白（抗原）。

通常情况下，在某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择，如何能选择到最适合该实验的二抗，需要综合以下几个方面进行考虑：

种属来源

一般根据一抗的种属来源来选择相应的抗该物种的二抗。例如：一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则为抗小鼠的二抗（山羊或是兔抗小鼠）。

抗体纯化

①亲和纯化：大部分偶联二抗可通过亲和色谱法纯化。

②预吸附：将含有二抗的溶液通过固定有血清蛋白（源自可能发生交叉反应的物种）的色谱柱填料。非特异性二抗将保留在色谱柱内，而具有高度特异性的二抗将流出色谱柱。

  • 预吸附的二抗已经过附加纯化步骤，因此其特异性提高且交叉风险降低；
  • 在使用吸附有源自亲缘关系较近物种抗体的二抗时，因为其表位识别能力已大幅下降并且可能对某些单抗的识别能力较差，选择时需更加谨慎。（了解更多抗体纯化方法）

抗体亚型

多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，相应二抗应为抗IgG抗体；单克隆抗体由于存在不同的类别和亚型，二抗选择时需要根据一抗类型或是亚类相匹配。

完整片段还是抗体片段

二抗分为完整抗体和抗体片段两种，使用哪种需要根据实验来进行决定。主要有IgG分子完整抗体、Fab片段以及F(ab’)2片段。

  • 较小的抗体片段能够更加高效地渗透组织，该特点对IHC及IF等实验应用特别有利；
  • 采用抗体片段可减少抗体Fc部分与细胞上Fc受体之间的非特异性结合，这一点在分析Fc受体含量高的特定组织（例如脾）时非常有帮助。

偶联物

二抗的选择还取决于偶联的标记物。二抗可以偶联不同标记物如酶（如HRP）、荧光素（如FITC）、生物素及同位素等，形成不同的标记抗体。偶联物的选择会对抗体灵敏度产生极大的影响；生物素偶联物有利于放大信号，聚合物的酶促偶联物或荧光偶联物也有利于放大信号。