高通量测序技术_测序原理/流程

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序（next generation sequencing，NGS）技术、大规模平行测序或深度测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。包括第二代测序技术、第三代测序技术和第四代测序技术。

第二代测序技术

第二代测序技术的核心原理是边合成边测序，其与第一代测序技术（Sanger法）相比，具有通量提高、成本降低、周期缩短，敏感性提高、读长变短等特点。目前具代表性的第二代测序平台主要有来自Roche公司的454法、Illumina公司的Solexa法和ABI公司的SOLiD法。

Roche 454法

Roche 454（GS-FLX）是一种基于微乳液PCR（Emulsion PCR）和焦磷酸测序技术的测序平台。其测序原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GS-FLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。

测序流程：

文库制备：将基因组DNA/cDNA打断成300-800bp长的片段，经末端修复与特异性接头连接修饰后，变性处理，回收单链DNA（ssDNA）。
Emulsion PCR：ssDNA与水油包被的磁珠在一起孵育，退火，接头使成百上千条ssDNA分别结合到磁珠上（磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列）（一个DNA片段=一个磁珠），扩增试剂使磁珠乳化，形成油包水的混合物，每个DNA片段在这个混合小滴里进行独立的扩增，从而实现所有DNA片段的平行扩增（emPCR）。
焦磷酸测序：经过emPCR扩增后，每个DNA片段将被扩增大约100万倍，预先用Bacillus stearothermophilus聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA片段的磁珠，然后将磁珠被放入Pico Titer Plate板中供（焦磷酸）测序反应使用。

优点：

读取序列长（400 bp）；短耗时；可进行从头测序（de novo sequence）。

缺点：

焦磷酸测序试剂成本相对较高；样本制备相对较复杂；无法判断重复碱基个数。

Solexa法

Illumina公司的Solexa/Hiseq技术是目前应用最广泛的二代测序平台。这两项技术，都是是基于桥式PCR和荧光可逆终止子的边合成边测序（SBS），其测序原理是：可逆终止化学反应，下面介绍了Solexa技术。

测序流程：

待测DNA文库的构建：将待测序列打断成200-500bp（或更短）的小片段，两头用酶补平后，在小片段两端加上不同的接头（adapter），连接载体，构建ssDNA文库。
DNA与流动槽（Flow Cell）的附着：Flow Cell是一种含有8条lane的芯片，每条lane的表面固定有很多（P5’/P7）接头（引物）。测序时利用微注射系统将已经加过（P5/P7）接头的ssDNA片段随机添加到Flow Cell内，ssDNA片段的P5接头序列与芯片表面的P5’引物互补，一端被“固定”在芯片上。
桥式PCR（Bridge PCR）向Flow Cell中添加未标记的dNTP和聚合酶，以ssDNA片段为模板合成出一条全新的DNA链（P5’-P7’互补链），然后再加入NaOH溶液，使DNA双链解链，由于模板链没有结合在lane上，模板链会被溶液流洗脱，但互补链仍固定在lane上。加入中性缓冲溶液，环境变成中性后，互补链的P7’与lane上P7接头互补杂交，形成桥型ssDNA，接下来加入dNTP和聚合酶，聚合酶就沿着P7接头合成出一条新的链（桥型ssDNA扩增为桥型dsDNA）。再加入NaOH碱溶液，使DNA双链解链，然后再加中和液，继续扩增，经过不断的扩增和变性循环（大约35个循环）后，最终每种ssDNA都将在各自的位置上集中成束（cluster），每一束都含有单个DNA模板的500-1000个拷贝，从而达到测序所需信号强度的模板量。
桥式PCR完成之后，再次强碱解链，采用一种酶–甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性的切掉lane上p5‘ 连接的链，只留下了与lane p7连接的链–Forward Strand。同时。添加ddNTP阻断延伸。形成cluster测序单元，可直接用于边合成边测序反应。
测序：向反应体系中添加DNA聚合酶、接头引物和带有荧光标记的4种dNTP（可逆终止子：dNTP的3‘羟基被叠氮基团替代，只容许每次添加一个dNTP）。dNTP被添加到合成链上之后，将剩余游离dNTP和DNA聚合酶洗脱。然后加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号，计算机分析并将其转化为测序结果。再加入化学试剂猝灭荧光信号，并使dNTP的3’叠氮基团变成羟基，继续进行下一轮测序反应。

优点：

高度自动化系统；读取片段多；适合大量小片段的测序（microRNA、lncRNA等）；高性价比。

缺点：

读取序列较短；不适于de novo sequence。

SOLiD法

寡聚物连接检测测序（supported oligo ligation detetion，SOLiD）法是利用DNA连接酶在连接过程中进行测序，其技术核心是：4种荧光标记寡核苷酸的连接反应。

测序流程：

DNA文库的构建：将基因组DNA/cDNA进行片段打断，并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建ssDNA文库。
Emulsion PCR：与454技术的Emulsion PCR类似，但磁珠比454小很多，只有1μm。将带接头的ssDNA固定在磁珠表面，进行PCR扩增，在扩增的同时对扩增产物进行3’端修饰，3’修饰的磁珠会被沉积在上样玻片（Slide）上，在上样过程中沉积小室将每张玻片分成1、2或8个测序区域。
连接酶测序：向体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和反应底物-8碱基单链荧光探针混合物（3’-XXnnnzzz-5’结构）。探针的5’末端分别标记了CY5、CY3、Texas Red、6-FAM四种颜色的荧光。在这个探针中，第1和第二位（XX）上的碱基是确定的，根据种类的不同在第6-8位（zzz）上添加了不同的荧光标记。这种由两个碱基确定一个荧光信号的测序方法被称为两碱基测序。当荧光探针与DNA模板链配对而连接时，会发生代表1,2位碱基的荧光信号。记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，移除荧光信号，以进行下一个位置的测序。通过这种方法，每次测序的位置都相差5位，即第一次测序的位置是第1、2位，第二次测序的位置是第6、7位……在测到末尾后，将新合成的链变性，洗脱。然后用通用引物n-1（在引物n的基础上将测序位置往3’端移动一个碱基，能测定第0、1位和第5、6位）进行第二轮测序。以此类推，再加入n-2、n-3、n-4进行测序，这样可以完成全部位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均被检测了2次。

优点：

高通量；高准确度；可分割测序区域；系统灵活可以进行样本的pooling。

缺点：

读取长度受连接反应限制；一旦在荧光解码阶段发生错误就容易产生连锁的解码错误。

第三代测序技术

第三代测序技术的显著特点是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，直接进行边合成边测序。该技术有两点是二代测序不具备的：一是直接测RNA的序列，第二个是直接测甲基化的DNA序列。目前具有代表性的第三代测序平台有美国Helicos Biosciences公司的HeliScope单分子荧光可逆终止技术和Pacific Biosciences公司的单分子实时（single molecule real time，SMAT）测序技术。二者均利用荧光信号进行测序。

HeliScope单分子荧光可逆终止技术

HeliScope单分子荧光可逆终止技术是基于边合成边测序的思想，测序过程无需对模板进行扩增，测序原理是：将DNA片段随机打断成小片段分别进行dNTP荧光标记，经过不断地重复合成、洗脱、成像、猝灭过程完成测序。

测序流程：

将待测序列随机打断成小分子DNA片段，在3’末端加上poly(A)，并在poly(A)的末端进行荧光标记和阻断。
将待测模板固定到芯片上（通过poly-A尾与固定在芯片上的poly-T杂交），制成测序芯片。
加入DNA聚合酶和被Cy3荧光标记的脱氧核苷酸进行DNA合成，每一轮反应只加入一种dNTP，然后将未参与合成的DNA聚合酶和dNTP洗脱。
采集Cy3荧光信号，然后切除荧光标记基团，加入下一种dNTP和DNA聚合酶的混合物，进行下一轮测序反应，如此反复，最终获得完整的序列信息。

优点：

高通量；避免PCR扩增引入错误，提高准确率。

缺点：

读长短；测序成本较高；单读长的错误率偏高，需重复测序以纠正错误；仪器非常昂贵。

SMRT

SMRT也是基于边合成边测序的思想，该技术以SMRT芯片（一种带有很多零模波导（Zero-Mode Waveguide，ZMW）孔（纳米级）的金属片）为测序载体。其基本测序原理是：不同荧光标记的4种dNTP，在碱基配对阶段，随碱基加入的不同，会发出不同荧光，根据光的波长与峰值可判断碱基类型。

测序流程：

将DNA聚合酶、待测序序列和被不同荧光标记的dNTP（标记的是磷酸基团而不是碱基）放入ZMW进行合成反应，由于ZMW孔外径仅100多纳米（比检测激光波长小），激光从底部打下去后不能穿透小孔，进入上方溶液区，能量均被限制在一个小范围里，正好能够覆盖需要检测的部分，从而使信号均来自于反应区域。而孔外未参与合成的dNTP由于未进入检测区，则不会发出荧光。
当一个被荧光标记的dNTP被加入到合成链上的同时，会进入ZMW孔的信号检测区，在激光束的激发下发出荧光，根据荧光种类可判断dNTP种类。
在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸基团被切割并释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个dNTP连接到位点上开始释放荧光脉冲，继续进行下一个循环。

优点：

测序速度快，每秒约10个dNTP；读长可达几千个碱基；不需要扩增，原始DNA不被破坏。

缺点：

仪器昂贵，测序成本较高；单读长的错误率偏高；DNA聚合酶在阵列中降解。

第四代测序技术

第四代测序技术又称“纳米孔测序技术”，是近几年兴起的新一代测序技术。另外纳米孔测序在国外也被归纳为第三代测序技术。目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是英国Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的单分子纳米孔测序技术（Nanopore sequencing）。

nanopore sequencing

nanopore sequencing是一种基于电信号测序的技术。其测序原理为：当DNA分子在通过纳米孔道时，会对通过纳米孔的电流或横穿过纳米孔的电流产生影响。不同碱基通过时，对电流产生的影响不同。利用这种差异，nanopore sequencing就可以识别基因中碱基（对）的排列顺序。

独特特点：能够直接读取甲基化的胞嘧啶。

测序流程：

α-溶血素为材料构建生物纳米孔，孔内共价结合有分子接头——环糊精，孔外一侧吸附有核酸外切酶。
将该系统镶嵌在一个脂双分子层内，为了提供既符合碱基检测又满足外切酶活性的物理条件，脂双分子层两侧应分别设定为不同盐浓度。
在适合的电压下，用核酸外切酶切割ssDNA，被切割下来的单个碱基落入纳米孔，并和孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，每个碱基均因其产生特有的电流干扰振幅而能够被区分。
碱基在纳米孔内的停留时间是毫秒级的，其解离速率常数与电压有关，180mV的电压即可保证在电信号记录后将碱基从纳米孔中清除。

优点：

测序读长长（超过150kb）；测序速度快；测序数据实时监控；机器方便携带等。

缺点：

采用水解测序法，不能进行重复测序；切断的核苷酸可能被读错方向；难于生产出带多重平行孔的装置，通量较小。

高通量测序技术的应用

转录组测序：研究细胞表现和功能
甲基化测序：表观遗传学标记信息
外显子组测序：研究定向富集的DNA
染色质免疫沉淀-深度测序（ChIP-seq）
基因组测序等。